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DNA的限制性酶切及电泳分析实验方法?

1. 反应体系的建立:⑴ 在一无菌1.5 ml Eppendorf管中加入:?无菌双蒸水 7 μl?10×酶切缓冲液 2 μl?质粒DNA(100 ng/μl) 10 μl?EcoRⅠ(5 U/μl) 1 μl?总体积为20μl⑵ 轻轻混匀,12000 rpm离心5 sec。

2. 37 ℃水浴1 h。3. 将Eppendorf管置65 ℃水浴中10 min,通过加热使酶失活以终止反应。4. 12000 rpm离心5 sec,将管盖及管壁上的水离下。5. 取10 μl消化产物,与2 μl 6×上样缓冲液混匀,琼脂糖凝胶电泳检测消化效果,电泳条件:约100 V 30~60 min。6 结果观察。操作注意事项:1. 吸样量一定要准确2. 为了不使酶污染而导致浪费,最后才加酶3. 要求在冰上操作,并充分混匀,4. 开启Eppendorf管时,手不要接触到管盖内面,以防污染。5. 样品在37 ℃与65 ℃保温时,将离心管盖严,以防水进入管内造成实验失败。限制性内切酶酶解中常见的问题和原因1. DNA完全没有被限制性内切酶切割:①限制性内切酶失活;②DNA不纯,含有SDS、有机溶剂、EDTA等;③非限制性内切酶最佳反应条件;④酶切位点被修饰;⑤DNA上不存在该酶的识别顺序。2. DNA切割不完全:①限制性内切酶活性下降或稀释不正确;②DNA不纯或反应条件不佳;③酶切位点被修饰;④部分DNA溶液粘在管壁上;⑤酶切后DNA粘末端退火。3. DNA片段数目多于理论值:①限制性内切酶星号活力;②存在第二种限制性内切酶污染;③样品DNA中含有其它DNA。可以到生物帮上查找这方面的信息啊,那里拥有生物领域内丰富的资源,有空的话,可以去 www.bio1000.com/zt/dna/164670.html 那里看下啊。

如何检测多余的css,DNA的限制性酶切及电泳分析实验方法